De retour de croisade, le chevalier Henri de Mullenheim, voulant rendre grâce au ciel de l'avoir épargné, décide de faire construire un couvent guillemite, dans le quartier de la Crutenow (aujourd'hui, Krutenau). Terminée en 1307, l'église se démarque des autres édifices religieux strasbourgeois, par la modestie de son architecture. Ordre mendiant, les guillemites n'aiment guère s'encombrer de fioritures artistiques et ostentatoires, qu'ils considèrent aussi coûteuses qu'inutiles.

L'autre grande caractéristique de cet édifice, est la présence, en son sommet, d'un clocher totalement asymétrique. Cette curiosité architecturale a donné lieu à deux légendes.
- Dans la première version, l'architecte de l'église, furieux de voir son "si bel édifice" affublé d'un clocher aussi "bancal", se bat à mort avec son charpentier.
- Dans la seconde version, humilié et déshonoré par la grossièreté de son erreur, l'architecte décide de se repentir en se noyant dans l'Ill.

Située en plein milieu du quartier des bateliers, Saint-Guillaume devient, au 14ème siècle, la paroisse de cette importante corporation. A cette occasion, son clocher est surmonté d'une ancre.
A la réforme, l'église "tombe aux mains" des protestants et devient l'une des 7 paroisses luthériennes de Strasbourg.
Enfin, en 1728, on y installe un orgue construit et dessiné par André Silbermann. A partir de cette date, Saint-Guillaume devient l'un des hauts lieux européens pour l'exécution d'oeuvres musicales religieuses.